metagenomics를 위한 논문 탐험

자 대략적으로 누구랩 레포트로 큰그림은 그려봤으니 실질적으로 논문들을 볼 차례다. 시작점은 a core gut microbiome in obese and lean twins로 한다. (참.. 이것 참.. 이 논문을 genomeweb에서 2년전쯤 논문 서머리로 슬쩍 본적이 있었는데 결국 보게 되다니. 참 이거. 참..) 그리고 CD-hit, species richness 통계 관련 논문, 마지막으로 mothur 논문 순서로 하기로 한다.
<A core gut microbiome in obese and lean>
http://www.nature.com/nature/journal/v457/n7228/full/nature07540.html


원래는 위에 것 할려고 했는데 윗분의 BGI언급으로 인해 아래 논문으로 수정
<A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing>
http://www.nature.com/nature/journal/v464/n7285/full/nature08821.html
이 논문의 위의 논문보다 나중에 나온것. 둘다 gut의 microbe 를 metagenome 연구를 했다는 공통점. 위 논문의 abstract만 보면 위 논문은 16s rRNA도 하고 전체 microbe의 genome (microbiome)을 시퀀싱 한거 같다. 이 논문은 Genome analyser (GA)를 가지고 124명의 유럽인들의 똥의 미생물의 microbiome, 그러니까 전체 genomic DNA를 시퀀싱. => 그래서 576.7 Gb 를 만들어냄(이전 논문의 200배, BGI에서 돈많이 썻다고 자랑함). => 그 뒤 assembly,=> 3.3 M 의 unique ORF 만들어냄. 그리고 마지막 말, 이 결과는 short read sequencing으로도 metagenomics를 할수 있음을 보인다는건데 이건 BGI가 illumina 계열의 기기만 있기 때문에 이것으로도 metagenome을 해도 된다. 뭐 이런 support를 위한 논문인냥 느껴지는 멘트이다. 그러면 short read sequencer로도 가능하냐? 이 문제에 대해선 다음의 논문[1] 을 추천하려 했지만.. 16s rRNA 에 대해서 물어본다면 답이 안되는 논문인듯 하다. 
metagenomic sequencing of gut microbiomes
124명의 건강하거나 과체중이거나 비만 혹은 염증성 장내질환(IBD)를 갖은 사람의 변의 microbe를 시퀀싱했다.두당 평균 4.5Gb 만들어냈고 이를 개인 각각 SOUPdenovo로 어샘블. 500bp 이상의 contig가 총 6.58M개 총 사이즈는 10.3Gb(N50 : 2.2kb), read의 42.7 %가 contig 만들어 지는데 이용됨. confirm으로 두 개체를 골라서 sanger 방법으로 시퀀싱한 리드를 contig에 매핑, 그 결과 98.7%가 맵핑됨. 이 값을 또 FLX와 비교(한 개체를 FLX로 시퀀싱한뒤 assembly해서 sanger read를 매핑해봄, 무서운 놈들). error-rate[2]와 뭐 이것저것 FLX에 떨어지지 않음을 증명. 어셈블 안된 리드들을 개체에 상관없이 모아서 다시 어셈블, 결과 0.4M개 총 370Mb(N50: 939bp) 의 contig 생성. 거꾸로 read들을 90% identity를 threshold(시퀀싱 error, strain variability를 고려해서)로 매핑, 결과 80%의 read가 매핑. 다른 논문의 데이터, 그리고 genbank와도 비교. 우월함을 입증.
a gene catalogue of the human gut microbiomes
ORF prediction에 MetaGene 사용. 100bp 이상의 ORF를 총 14,048,045개 찾음. 이건 총contig길이의 86.7%. 이는 평균적인 microbe의 비율과 비슷. (2/3의 ORF가 incomplete하다는데.. 이걸 어떻게 알지? incomplete하다의 의미가 정확히 뭔지 모르겠다). 그 ORF들의 redundancy를 없애고 총 3,299,822의 ORF로 추려냄, 이를 prevalent genes 이라고 함. 이 prevalent gene을 genome sequence가 있는 장내 세균과 비교. 상당수 매치됨. 음.. EstimateS 라는 프로그램을 써서 ICE를 계산해서 자기네들이 찾은 prevalent gene이 전체 추측되는 prevalent gene의 몇 %를 capture했나 라는 말이 나오는데 아.. 이는 잘 이해가 안된다[3]. 결론은 85% 이상을 capturing 한것으로 여겨진다는 것. 그리고 개체간에 얼마나 common gene이 있나를 체크했는데, 생각보다 prevalent gene이 생각보다 소수에 치우쳐 있다는 식으로 이야기함. 이것의 한 factor로 sampling depth를 들음. 그러나 역시나 개체간에 share하는 prevalent gene은 상당함. 재밌는것은 IBD 환자의 prevalent gene이 정상보다 갯수가 적음. 이는 IBD환자의 장내 미생물 diversity가 일반인보다 적다는 것과 일맥 상통.
common bacterial core


functions encoded by the prevalent gene set
ORF들을 NCBI의 NR(protein)과 KEGG, COG, eggNOG[4]에 있는 gene에다가 align함.[5]
bacterial functions important for life in the gut
functional complementarities fo the genome and metagenome








[1]http://aem.asm.org/cgi/reprint/74/5/1453.pdf 이논문이 2008년 초에 나온건데 abstract를 보면 100-200 bp의 read로 16s rRNA 시퀀싱 분석이 괜찮냐를 본 논문. 방법은 간단해 보인다. 거의 full length의 16s rRNA와 random하게 만들어낸 short read의 blast와 cog 분석 결과를 비교한다. blastx의 결과 당연하지만 full length에 비해 homolog hit이 현저하게 떨어진단다. 주의할 건 400bp 까지 read의 길이를 늘려도 내지는 depth를 늘려도 마찬가지라는거. 결국 Evalue가 낮은 hit 아니면 찾기 어렵다는것. 그리고 cog 분석도 마찬가지로 full... 근데 이거 16s rRNA에 국한된게 아닌듯 싶다. 그리고 nature 논문은 assembly후에 분석한 거라 이 의미가 없을 듯
[2]error-rate : 
[3]EstimatorS, ICE : http://viceroy.eeb.uconn.edu/EstimateSPages/EstSUsersGuide/EstimateSUsersGuide.htm
[4]eggNOG : http://eggnog.embl.de/
[5]rarefaction analysis :