요즘 구제역이다 뭐다 해서 가축들을 죄다 땅에 파 묻는 바람에 지하수에 구제역에 의한 오염이 있지 않나 뭐다나 해서 농진청에서 연구비를 지원하나보다. 덕분에 회사의 가장 힘없는 말단 사원인 난 metagenomics 세계로 뛰어 들게 된다(근데 들어보니 구제역은 바이러스 때문이라는데..). 평소에 metagenomics에 대해 생각이 없었는데.. 예전에 천교수님 발표 할때 들어보고.. 아 꽤 시장이 크구나라고 느낀게 전부인데.. 나는야 까라면 쪼금 반항해보고 결국 까고 마는 말단 사원이다(아.. 연구원이다.. 사원보다 월급 적게 받는).
뭐 덕분에 공부한다고 생각하고 하나하나 정리해보자.
metagenomics 란 무엇인가?
rRNA
metagenome 시퀀싱을 하면 일반적으로 rRNA를 시퀀싱한다 (물론 그냥 gDNA를 culture해서 orf도 prediction하고 protein 시퀀스를 이용해서 functional annotation도 하지만). 아직 까지 내가 아는 지식으론 아마도 그 orgamism들의 구성도를 보기 위해서? 여튼.. 아래 위키 for rRNA explanation
http://en.wikipedia.org/wiki/Ribosomal_RNA ribosomal RNAs는 LSU(large subunit), SSU(small subunit) 으로 구성되어 있는데 prokaryote의 경우 LSU로 50S가 SSU로 30S 가 있고 그 30S를 구성하는 rRNA가 바로 16S rRNA. 보통 rRNA sequencing 중 16S rRNA 시퀀싱을 많이 하는데 그 이유를 생각해 보자면 http://en.wikipedia.org/wiki/16S_ribosomal_RNA 에 마지막에 보면 16S rRNA에 universal primer를 쓸수 있을 정도로 conserved 한 region도 있고 반면에 굉장히 변화가 심한 hypervariable region도 있기 때문에 아마도 species를 구분하기에 적당해서가 아닐까.
참고로 다음 논문도 읽어볼만 할듯하다.
Ribosomal RNA : a key to phylogeny
http://www.fasebj.org/content/7/1/113.full.pdf#page=1&view=FitH
metagenomics 분석 어떻게 해야 하나?
http://mmbr.asm.org/cgi/content/short/72/4/557
metagenomics를 위한 bioinfomatic 가이드라는 제목의 review인데.. 꼭 읽어봐야 할듯. intro 바로 처음에 나오듯이 이 리뷰는 functional metagenomics (특정 activity가 있는 것만 골라내서 cloning 해서 시퀀싱 한거)랑 구분하여 50Mbp 이상의 randomly sampled sequnces를 분석하는 가이드.
관련 데이터 베이스
들어보니 Silva, greengenes, EZ_taxon 이렇게 3개가 가장 많이 사용되는거 같다. 몇개 찾아보니 Silva가 가장 잘 되어 있는 느낌(?)이 드는데 우선 관련 논문
<Silva>
http://nar.oxfordjournals.org/content/35/21/7188.full?keytype=ref&ijkey=pwbw9T96ADMbJBk
일단 이러한 데이터 베이스의 목적은 넘쳐나는 rRNA데이터를 careful inpection, 그러니까 curration을 통해 rRNA가 biodiversity 연구에 도움이 되도록 하는데 있다(unified quality control & alignment of rRNA datasets).
논문을 보니까 rRNA 를 이용한 phylogeny의 연구에 ARB 라는 software와 이를 위한 db를 많이 썼었던걸로 보인다. ARB 말고도 rRNA curation을 위한 3개의 main project를 소개한다(greengenes, RDP,그리고 하나가 european rRNA 데이터 베이스인데 이것이 Silva로 들어 간것으로 보인다.). 아 그리고 하나 greengene에서는 ARB compatible dataset을 가지고 있긴 한데 full length인것만 대해서만. 그리고 요즘은 LSU rRNA도 많이 사용한다네(특히 eukaryote의 경우). intro을 본 결론은 4개의 DB 그중 ARB랑 european rRNA은 Silva로 편입된거 같다.
-Sequence data
Silva의 버젼은 EMBL과 버젼이 똑같다. 곧 RNA와 관련된 키워드 모두 검색해서 EMBL에서 RNA 시퀀스를 가져온다는 말. 그리고 seed alignment를 제공한다는데.. silva의 예전 버젼 격인 ARB에서 release 한것을 그대로 유지한다는데.. 이 seed alignment라는게 뭔지 잘 모르겠다..
-Quality checks
1.unaligned uncleotides 중 300bp보다 짧거나, 2. 2%이상 ambiguities가 있거나, 3. 아니면 2%이상의 homopolymer (homotetramer(homo-4bp)이상)가 있거나, 4. vector랑 5%이상 매치되면 제거. 그리고 이 세가지(2,3,4 항목)의 평균을 구해서 100에서 빼면 이것이 sequence quality가 된다. 이후 필터링 통과한 시퀀스들은 seed alingment에 대해 SINA(silva incremental aligner)에 의해 alignment가 되어 진다. 근데 이 sequence quality로 뭐하는 것인지.. 이미 4가지 항목으로 필터링 했는데 그 뒤에 이 sequence quality를 왜 구하는건지..이 역시 아직 잘 모르겠음
-Aligner
ARB의 suffix tree[1] 방식을 이용해서 seed alignment에서 최대 40개까지 유사한 시퀀스를 찾는다. 이렇게해서 찾아진 시퀀스 들은 partial order graph[2]로 옮기고 이 graph 위에다가 query를 needleman 방식으로 align 한다. 이 과정에서 alignment quality와 basepair score를 구하고 이는 0~100 사이 값으로 normalized 한다. alignment를 마친뒤에 aligned된 bp가 300bp보다 작으면 버린다.
-Anomaly check
이건 seed sequence의 anomaly를 체크 하기 위한 것이거 같은데. pintail이란 프로그램을 사용한단다. seed sequence들 전보를 20 개의 sequence로 된 한 그룹에 대해 pairwise check를 하는데 만약 대부분의 alignment가 anomalous 하게 나오면 seed에서 제거한다는거 같은데.. 저 20개의 sequence가 정확히 뭔지 모르겠다.. 모르는거 투성이네. 에이
-Taxonomy
-Nomenclature
-SSU and LSU rRNA databases for ARB
Ref databases: Parc database의 subset, 1.length cutoff :거의 full length의 시퀀스(최소 1200bp). archaea의 경우 800bp. LSU의 경우 1900bp. 2.alignment curoff : alignment score가 SSU의 경우 50, LSU의 경우 30 이상. 이 뒤에 positional variability filtering이 있는데 잘 이해 안됨.
Parc databases: 위의 quality가 확인된 모든 sequences
[1]suffix tree: 이진트리나 레드블랙트리는 봤어도 suffix tree는 사실 제대로 본적이 없다. 금선생이 추천해준 책에 몇챕터에 걸쳐서 나오는데.. 아.. 역시 모든 지식은 연결된듯하다. 여튼 급한데로 훓어보는데.. http://graphy21.blogspot.com/2011/03/suffix-tree.html
[2]http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/18/3/452.full.pdf#page=1&view=FitH
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