자료 for gut metagenome

Gut Reaction : Environmetal Effects on the Human Microbiota
http://www.medscape.com/viewarticle/705512

comparison of coverage between Exome Capture Kits

아.. 난 metagenome 논문 보고 싶었는데.. 급하게 exome capture kit 비교 했던거 정리하란다. 해야지. 목표는 단순하다. 3가지의 exome capture kit의 coverage를 비교하는 것. 결코 이 표에 대한 accuracy는 보증하지 않는다. confidential 한 문제도 있고 해서리.. 


하려는 걸 단순화 해보자. 
exome capture kit들을 (SeqCap EZ Human Exome Library v2.0,  SureSelect , TruSeq Exome Enrichment Kit )의 genome coverage를 비교하자. exome capture kit이니까 특히 exon 부분의 coverage를 유념해서 본다. 그럼 exome region의 definition은 뭘로 할거냐. 여러가지가 있겠지만 refseq과 ccds로 한다.


<결과> 

%이 표에서 단순 coverage는 probe design position 과 exon의 position 만 단순하게 비교. 그렇기 때문에 한 probe가 genome 상의 한 위치에서 디자인 됐지만 똑같은 시퀀스가 genome 상의 다른 위치에 존재할 때 원리적으로는 다른 곳도 커버하는 것이지만 그것까지 카운트 하지 않음.


<출처 >
1.SeqCap EZ Human Exome Library v2.0 : Roche 홈피에 오픈
2.SureSelect : 이는 agilent errary인가에 오픈되어 있는걸로 알고 있는데 아직 확실치 않다.
3.TruSeq Exome Enrichment Kit :  이는 web에 오픈되지 않음.
4.exome region : UCSC의 table에서 가져옴. 






< 이번 작업을 하면서 알게 된것 혹의 주의 할점 >
1.bed 파일과 UCSC의 데이터의 모든 좌표의 start position은 0-based고 end position은 아니다.
2.refseq과 ccds의 특정 gene들에 대한 record가 여러번 나오는데, 다시 말하면 동일 유전자가 genome 상의 서로 다른 위치에 존재 할수 있기 때문에 같은 gene accession id 를 갖는 record가 있을 수 있다(ccds의 경우 23개, refseq의 경우 2991개). 
그런데 하나 이상한건.. refseq. 동일한 gene acc가 여러개의 record가 나온다는 걸 난 동일 유전자가 서로다른 genome상에 위치 하기에 그렇다고 해석했는데.. 그렇다면 동일한 gene acc를 갖는 record들은 최소한 exon 의 갯수와 그 genome size가 동일해야 하는데 refseq의 경우 다수 record를 갖는 gene acc가 2991인데 그중에 613개의 gene acc의 record는 그것이 다르다는 것(ccds의 경우 23개 모두 record가 동일). 이게 어찌된 일인지.. 누가 알려주세요.. 

Enterotypes of the human gut microbiome

metagenome pipeline 1차로다가 만들고 난 후 요즘 genome NCBI에 submission 할려고 그것에 정신없느라 거의 논문이나 관련된 것들을 못봤다. 오늘은 metagenome 논문 하나 보고 그 담에 고걸 가지고 ppt를 만드는데 Prezi를 써볼련다. 아.. 떨려.. 과연 오늘 안에 다 할련지, 저녁에 회식도 있는데.. 딱 오늘까지만 할려고 하는데 해봐야지.
일단 metagenome 손 놓고 있으니 점점 맘이 떠나 갔는데 박사님이 던져준 논문 하나와 그 의도가 나를 그냥 바짝 interested in 하게 만들었다. 요즘 아니지.. 쫌 됐지.. 사람 똥으로다가 metagenome논문이 종종 나오는데(내가 알기로 이거 무슨 society가 있다) 특히 obesity 에 관해서 논문이 꽤 있다. 이번 논문도 그런건데(아직 확실치 않다. 읽어보지 않아서).. 여튼 그 의도가 뭐냐? 이거 사업성이 있다. 단순히 metagenome분석 해준다 하면 pipeline 만들고 돌려서 결과 report 해준다고 생각했는데.. 이거 진단으로도 갈 수도 있겠다. 이럼 이야기가 달라진다. 아니.. 나에 대한 자극도가 달라진다. 재밌겠다란 생각 든다. 함 보자.


일단 논문은 여기. 

Enterotypes of the human gut microbiome on Prezi

Prezi

오늘 회사 월례회. 월례회가 어떻고 저쩌고 이야기 하고 싶었으나 건 생략하고 걍 포스팅 하고자 하는 내용만 이야기 한다. 일단은 왜 프리젠테이션에 대한거냐? 오늘 팀별 소개로다가 이선욱 부서장이 발표를 했는데 ms office 가 아닌 adobe flash(?) 로 발표를 했다. 오.. 신선하다. 차별화다. 음.. 실험팀인데 이런 것도 도입하다니.. 쫌 부끄러운데.. 해서 일단 한번 대충이라도 알아보자는 차원으로 포스팅 하고.. 담번에 프리젠테이션 만들 때는 반드시 꼭 MS office가 아닌것으로 해보리라.


처음 찾은 것은 여기. 
음 여기서 보게 된것이 Prezi, Adobe Acrobat을 이용한 프리젠테이션. 아하 보아하니 이선욱 부서장이 Prezi를 이용해서 만든거 같군. 한번 Prezi를 알아보자.


<Prezi>
일단 사이트는 요기. 아.. 영어다.. 아무리 아무리 영어는 많이 봐도 그 거부감은 어쩔수 없다. 해서 다른 리뷰 사이트를 찾아보자. 한국 Prezi 사용자 카페도 있다.. 헐.. 프레지 책 영역을 보면 어떤 훌륭하신 분이 초보자를 위한 manual도 만들어 놨다. 헐.. 이런 봉사 정신을 봤나.. 아 근데 Prezi 돈내는거 갑다. 아.. 아카데믹하게는 공짜로다가 쓸 수 있는거 같긴 한데. 괜찮다 난 아직도 배우고 있는 학생이라고 평소에 생각하니 죄책감 없이 그냥 아카데믹으로 써봐야 겠다. 아 manual의 Prezi의 history를 보니 TED에서 투자한다네. 그래서 그런지 홈피 첫 화면에 TED가 있었군. 


사용 방법은 manual 참조. 너무너무 잘 만들어놨다.

submission of genome - 4

NCBI submit 하면서 Q&A 와 최종 정리


genbank에 있는 genome의 annotation은 정해진 규칙이 없다. 곧 각자 어느정도의 로직을 가지고 annotation을 한것이며 NCBI에서 체크하는 것은 각 sequence의 id가 겹치지 않게끔 체계를 갖게 하는것 뿐이다. 


protein_id 는 locus tag를 따르기를 권유한다. genome submit하고 나면 나중에 protein들에 대한 accession number가 NCBI로 부터 할당되어 통보된다.


<Sequin 프로그램에서 주의 사항>
1. topology 변경
2. codon table 변경
3. protein page랑 annotation page는 넘겨도 된다. 나중에 sequin feature table로 로드하면 됨.
4. gene이 reverse strand 일때 annotation input 파일에서 end position이 start position보다 앞에 나와야 한다.
5.다 만들었다 싶으면 search에서 validate를 실행.


Sequin 프로그램이 오작동 하면 이건 input 파일이 잘못 된거다(내가 겪은 예로 genome 이 circular 인데 orf가 -strand로 genome 끝에서 다시 처음으로 연결된 orf가 있었다. 이때 위의 3번 주의 사항으로다가 아무 생각없이 annotation input file을 만들었더니 계속 오류가 나더라. 결국 다시 genome 셋팅하고 annotation position 다 바꿈).

submission of genome - 3

아직 NCBI에 submit 하는걸 완벽히 다 안거는 아니지만(특히 sequin 프로그램 사용법이 아직 약하다) 이번에는 journal of bacteriology 의 genome announcement 에 대해 좀 자세히 알아 보고 거기에 나온 논문 두개 정도 읽어보면서 어떤 내용을 넣어야 할지 정해보려 한다.


일단 뭔가를 읽기 전에 checklist를 생각해보자면..
1. 반드시 NCBI 등이 데이터베이스에 등록이 된 genome만 publish가 가능한가 확인
2. 500 words 안으로 써야 하는데 어떤걸 써야 하는가
3. annotation의 reference를 어떻게 처리 했나?




<genome announcement 논문 훓어보기>
뭐 어떤 균주냐 이런건 안 중요하고 
review 첫번째 논문
1.균주에 대한 intro: genus부터 소개, 왜 중요한지, source가 어딘지, 어떤 특성을 갖는지 등등
2.de novo assembly 전체적인 소개 및 annotation 방식 소개: 무슨 기계로 얼마만큼의 데이터를 만들어 냈는지 그리고 assembler로 뭘 썻는지,  CRITICA와 glimmer2를 이용해서 cds를 prediction했고, 그담이 이해가 안가는데 GO로 분류했고 상용 프로그램인 뭐를 썻다네.
3.genome에 대한 overview : 게놈 사이즈가 어떤지, ORF 갯수, 그리고 같은 genus 의 다른 species와의 길이 및 orf 갯수 비교. GC content.
4.orf annotation에 대한 overview : nr,cog blast 결과 보고. 다른 species에 없는 기능을 하는 유전자 소개


review 두번째 논문 
1.균주에 대한 intro : 이 균주는 beneficial 한 균주다 뭐 이런 내용.
2.또 균주 소개
3.시퀀싱 방법과 annotation 에 대한 내용: 이거 특이하게도 AB3700 DNA analyzer를 이용했다. 물론 solexa로 confirm을 하긴 했지만. 여튼 Yacop으로 orf  prediction했고 Uniprot, COG, KEGG, TIGRFAMs을 이용해 annotation했단다.
4.genome 에 대한 설명 : genome size, GC content, structural RNA 갯수, 몇개의 유전자가 putative function이 있는지, 


음 보아하니 유전자에 대한 comment 가 있어야 할 듯 하다. 다른 species와의 비교로 어떤 유전자가 더 있었다 이정도.. 


<genome announcement 논문 들어가야 할 list>
실험 방식(FLX+ sanger 3730), FLX 데이터 양(read, depth, paired-end), de novo assembler(GS De Novo Assembler version), 첫 de novo assembly 했을시 scaffold 갯수 및 양, sanger 3730으로 gap closing 시 read 양과 bp 길이, 어떤 프로그램 (phred/phrap/consed), annotation tool(glimmer3, rnammer, trnascan,) 및 방식(nr blastp, cog rpsblast, signalp, pfam) 




reference list도 10~15 개 정도로 하고, 쓸데 없는 말은 전부 배제하기로 한다. 논문 본연의 목적에 맞게 쓰도록 한다. 딱 지금 한 것만 쓰자.

submission of genome - 2

여행 다녀왔는데.. 봄이라.. 아.. 몸살인지 감기인지.. 거의 좀비 상태다. 아.. 힘들어 죽을거 같어.. 휴가를 내고 싶지만 벌써 놀러 갔다 오느라 이틀을 쓴 상태라 최대한 아끼려는 생각에.. 버텨볼려 했다가 탈수에 병원 응급실까지가서 드러누워버리는 바람에.. 내 태어나서 이리 고생해보긴 첨인듯. 아직도 머리가 어지럽지만.. 집에서 드러누워 티비보면 뭐할쏘냐.. 병이 낫는것도 아니고, 빅토르 위고는 억지로라도 글쓸려고 하인시켜서 가운가지고 가게 했다는데 같은 심정으로다가 회사에 일단 왔으니 뭐라도 좀 하고 가자..


일단 저번에 포스팅하면서 genome project 등록했고 locus tag prefix 까지 등록을 했으니 annotation 부분을 좀더 자세하게 읽어보고 Sequin 사용법을 알아봐야 할 것이다.


<annotation>
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/genomesubmit_annotation.html#disrupted_genes
일단 annotation 에 들어갈 feature들(gene, CDS, 등등)은 feature table(five-column tab-delimited table) 파일 안에 다 들어가 있어야 한다. 이 feature table 파일이란게 뭐냐 그럼. 이게 Sequin이나 tbl2asn 프로그램의 input 파일인 듯 싶다. 그럼 컬럼이 5개라고 했는데 뭐가 들어가냐? 1.start location of feature, 2.stop location of feature, 3.feature key, 4.qualifier key, 5.qualifier value.
딴건 별내용 없고.. 아 중요한거 하나 feature table에 맨 첫줄에 >하고 나서 seqid를 넣어야 하는데 이는 fasta 파일의 seqid와 동일해야 한다. 그런데 뭘 seqid로 정하냐? 아하.. 이거 임시다. 아무거나 정해도 된다. NCBI staff가 review 할때 accession number로 바꿔준단다.  protein id는 locus id랑 동일하게 하면 될것 같고, CDS 가 반드시 product qualifier (protein name)이 있어야 하는거 같은데.. naming 에 대해서는 주의해야 할건.. function, cellular location 같은 정보를 이름에 담지 말아햐 한다(이는 note feature에 넣을 것). protein의 unkown 일때 hypothetical protein이라는 용어를 쓸것. 여차함 gene symbol이랑 같은거 쓰는데 단 첫글자는 대문자로 할것. multigene family에 속하는 것들(이게 좀 이상한데 multigene family 에 대한 항목과 sequence similarity나 function share에 의한 homology 항목을 분리 시켰는데 같은 의미 아닌가?) 숫자로 구분하고 복수형 단어는 사용하지 말것. 기능이 알려지지 않은 protein인데 defined domain을 갖었을 때 -containing protein 이라고 명명할 수 있다.
notes feature에는 데이터베이스의 entry와의 sequence similarity 를 넣는것을 피하란다.
tRNA의 경우 어떤 amino acid에 해당하는것인지 명시하고 잘 모르겠으면 tRNA-Xxx 라고 하란다. 
글고 2005년 미팅으로 /experimental과 /inference 라는 항목이 정해졌다는데 이 설명은 여기.
해석해보자면.. 2005년에 INSD, DDBJ, EMBL, GenBank 모여서 회의했을 때 feature의 evidence 항목에 대해서 새로히 뭔가 정했다는데..기존의 evidence=expermental이라는 항목을 대체해서 /experimental=text 라는 항목과 /inference=TYPE:text 라는 항목을 넣자고 정했단다. text는 규격화된 text(곧 설명한다)를 TYPE에는 정해진 list에서 뽑아서 선택하는거. experimental 항목은 말그대로 실험한 내용쓰는거, 단 간단하게. inference는 non-experimental evidence를 명시하는것. TYPE은  11가지중 하난데.(이건 직접 링크 따라가서 보자) 


??궁극적으로 의문이 드는건.. 그렇다면 annotation의 제한은 없다는 건가? 누구는 이런식으로 ORF를 prediction하고 또 prediction한 ORF의 protein을 특정 방식으로, 그러니까 sequence similarity로 만 따져서 protein naming을 해도 되는 것인가? 아.. 이거 그냥 inference 항목으로 사용한 프로그램 명시하면 되는건가? 뭐.. 관리자한테 메일 보냈으니 답장오겠지..근데 전에 COG 관련 해서 질문했다가 씹힌거 같은데.. 제대로 올려나 모르겠네. 


<Sequin>
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/QuickGuide/sequin.htm
사실 이 프로그램 별거 아니다(아.. 다만 내가 하려는거에 한해서만 이야기 하자면). 위의 feature table을 genbank format으로 바꿔주는건데.. (내가 만든 파이프 라인 돌아가면 biopython을 이용해서 genbank 파일 만들어주긴 하지만 아무래도 혹시나 라는 생각에 그냥 이거 쓰기로 한다) 뭐 여튼.. 
fasta 파일을 일단 읽어들이는데 의문점 하나가.. nucleotide sequence가 하나 이상의 protein product를 endoing 하면 2개의 파일, 그러니까 하나는 nucleotides, 다른 하나는 protein 을 위한 파일이 필요하다는데.. 이건 뭔소린지.. 더 읽어봐야 알듯. 글고 fasta 파일의 title 그러니까 첫줄( > 있는 라인) 에 각종 modifier를 이용해서 정보를 넣을 수 있는데 어떤 modifier를 써야 할지 모르겠다면 그냥 note 라는modifier를 써라(staff이 바꿔준단다).