OMIM.org

https://academic.oup.com/nar/article/43/D1/D789/2439148/OMIM-org-Online-Mendelian-Inheritance-in-Man-OMIMR

OMIM (Online Medelian Inheritance) 은 의사인 Victor A. McKusick에 의해 1966년에 출판되기 시작한  유전자와 유전적 표현형의 정보와 그 사이의 관계를 정리한 내용의 MIM (Mendelian Inheritance in Man) 이 시초로 1987년 검색 가능하도록 온라인화 된 것이다. 다른 데이터베이스와는 다르게 OMIM 은 전문가들에 의한 생명과학 및 의학 관련 문서의 리뷰를 바탕으로 정보를 제공한다.  

2014년 10월 30일 기준으로 14,831개의 유전자와 7,894의 표현형의 정보를 담고 있다. (https://omim.org/static/omim/data/mim2gene.txt 를 보면 OMIM의 담고 있는 유전자와 phenotype의 갯수를 파악할 수 있다)

OMIM SOURCE MATERIAL

45개 이상의 저널, PubMed의 타겟 검색, Current Contents, 그리고 저자 기반의 전체 논문을 리뷰한다. 유전자와 표현형의 관계에 대한 통찰력을 줄수 있는 인간 생물학, 또는 질병에 대한 임상적 특성, 질병의 발생 원인에 관한 내용의 논문을 우선시 한다.

OMIM STRUCTURE

OMIM의 구조는 아래 그림과 같다. OMIM에서 하나의 유전자에서의 각각의 변이(variant)는 서로 다른 표현형과 연관되어 있을 수 있기 때문에 유전자와 표현형은 분리 시켰다. 그리고 변이 관한 정보는 유전자에 포함되고 임상적 개요나 임상적 묘사는 표현형에 포함시켰다. 

OMIM의 식별자인 MIM number는 6자리 숫자로 되어 있으며 첫번째 숫자가 1,2,6일 경우에는 Autosomal entry, 3으로 시작하면 X-linked entry, 4로 시작하면 Y-linked entry, 5로 시작하면 mitochondrial entry 이며 소숫자리 4자리는 variant 의 식별자로 사용된다.

MIM number (OMIM의 일련 번호) 앞에 붙어 있는 심볼은 아래의 분류에 따라 붙이게 된다.

• asterisk (*) : 유전자를 의미, mim2gene.txt 파일에서 "gene"이라고 분류되어 있음

• number symbol (#) : 표현형을 의미. molecular basis known. 하나의 유일한 locus 에 의한 표현형이 아니라 여러 유전자 혹은 하나의 유전자에 의한 것이라도 발병의 원인이 다양한 경우(homozygous or compound heterozygous mutation)의 표현형. mim2gene.txt 파일에서 "phenotype"이라고 분류되어 있음

• plus sign (+) : 유전자 이자 표현형. mim2gene.txt 에서 "gene / phenotype"으로 분류되어 있음

• percent sign (%) : 확인된 mendelian phenotype 혹은 phenotypic locus이긴 하나 정확한 기작은 모르는 경우(원인 variant까지는 모르는 경우). no known inheritance pattern or molecular basis.  mim2gene.txt 파일에서 "phenotype"이라고 분류되어 있음

• No symbol ( ) : mendelian 기반의 phenotype으로 보이나 의심스럽거나 다른 entry와의 구분이 명확해보이지 않은 표현형. mim2gene.txt 파일에서 "predominantly phenotype"이라고 분류되어 있음

• caret (^) : legacy, 곧 다른 mim number로 바뀐 entry

OMIM의 entry는 gene 과 phenotype로 구분되어 있다.

• gene 은 위 심볼에서 "*" 과 "+" 를 갖는 entry 이다. 
• gene은 아래의 것들을 포함한다. 
• protein-coding gene
• regulatory elements
• micro-RNA
• non-coding RNA
• 그 밖의 functional element 들이다.

• phenotype 은 MIM number 앞에 "#", "%", no symbol 의 심볼이 붙는 entry이다. 
• phenotype은 아래의 것들을 포함한다.
• single gene mendelian disorder, 
• phenotypic traits (머리색같은 것들), 
• susceptibility to drug reaction (와파린에 대한 감수성 같은 것), 
• reaction to infection (HIV 의 감염에 따른 AIDS의 발병과 같은 것), 
• germline susceptibility to cancer(BRCA1/2 같은 것),  
•  recurrent deletion and duplication syndromes

CLINICAL SYNOPSES

clinical synopses (임상 개요)라는 것은 문헌으로 부터 뽑아낸 phenotypic feature를 semi-controlled vocabulary 로 정리한 것. 이는 HPO, SNOMED CT, UMLS 등의 vocabulary DB에 mapping되어 있다.

THE GENE, MORBID AND SYNIOSIS MAPS

• Gene Map : 유전자의 cytogenetic location
• Morbid Map : disorder(phenotype)의 cytogenetic location

OMIM에서 gene map table 로 검색을 하게 되면 정보를 유전자, locus와 그것에 관련된 phenotype정보를 테이블 형식으로 나타낸다. 곧 gene, phenotype, 그리고 게놈상의 위치 정보를 정리된 표로 나타낸다. 

이 표에 phenotype column에서 사용되는 기호의 의미는 아래와 같다.

• brackets [] : non-diseases. 질병이 아님. 실험실에서  비정상적인 테스트 값을 나타내는 유전 변이.
• braces {} : 천식이나 당뇨병과 같은 multifactorial disorder (다원인 질병, complex disease) 나 감염에 대한 감수성과 관련된 phenotype
• question mark ? : phenotype과 gene과의 관계가 잠정적인 경우를 의미. comment 부분에 더 자세한 설명이 되어 있다.

또한 표의 pheno map key에 컬럼의 숫자의 의미는 아래와 같다.

• 1 : The disorder was positioned by mapping of the wild type gene.
• 2 : The disease phenotype itself was mapped (The disorder was placed on the map by statistical method).
• 3 : The molecular basis of the disorder is known.
• 4 : The disorder is a chromosome deletion or duplication syndrome.

REPRESENTATION OF GENE-PHENOTYPE RELATIONSHIPS

AV (Allelic Variant)는 OMIM의 gene-phenotype 관계에서 핵심이 되는 부분으로 아래의 기준으로 선별된 변이들이다.

• The first mutation to be discovered
• high population frequency
• distinctive phenotype
• historic significance
• unusual mechanism of mutation
• unusual pathogenetic mechanism or distinctive inheritance

NGS의 기술로 인해 variant가 급격하게 밝혀짐에 따라 2013년 1월 부터 OMIM은 gene-phenotype 관계가 성립되기 위한 아래의 기준들을 마련하였다.

• 동일한 유전자의 pathogenic variant를 가진 서로 관계가 없는 다수의 개인들이 존재할 경우
• multiplex family(질환을 있는 환자의 1 또는 2촌 가족 구성원이 같은 유전 질환을 갖는 가족) 에서 variant가 phenotype에 따라 segregation될 경우
• variant가 통계적으로 유의한 숫자의 개인에게서 de novo로 발생할 경우

qualified gene-phenotype relationship을  위한 기준은 아래와 같다.

"variant에 대해 오직 하나의 multiplex family 의 경우만 밝혀진 경우" AND "supportive functional data가 있는 경우 (in vitro, in vivo 의 유전자 활성 실험이라던지 모델 생물체에서의 비교할만한 phenotype 데이터가 있다던지)" 

OMIM PHENOTYPIC SERIES

https://omim.org/phenotypicSeriesTitle/all

비슷한 phenotype들의 genetic heterogeneity (하나의 phenotype 가 여러 개의 원인, 곧 allelic variant나 non-allelic variant에 의한 것)를 표의 형태로 나타낸 것. 정의가 잘 된 phenotype의 새로운 원인 유전자가 발견되거나 different mapping (genome상의 다른 위치에 관련이 있게 된다거나)이 될 때 series('PS'로 시작되는 identifier)를 생성하여 관련 phenotype을 연결시켜 놓는다. 현재 387 개의  series가 있다.

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Molecular diagnostic experience of whole-exome sequencing in adult patients

http://www.nature.com/gim/journal/v18/n7/full/gim2015142a.html

성인(18세 이상)에서의 WES의 결과의 특성과 진단에 대한 것을 정리한다. 이 논문은 계속적으로 2014년에 JAMA에 출판한 소아 대상 WES 의 결과들의 분석 과 비교함.

WES를 통해 소아의 경우 25% 정도 진단이 되는것에 비해 성인의 경우 17.5% (85/486) 의 비율로 진단이 됨. 18-30세의 경우 23.9% 진단이 되고 30세 이상의 경우 10.4% 진단이 됨. 두개의 질병이 진단된 경우는 7%. 신경계, 골격계, 머리, 목, 성장에 장애가 있는 경우에 진단이 되는 빈도가 높음. 진단 비율은 가족력의 정보의 유무와 상관없고 autosomal dominant 의 61.4% 는 de novo mutation에 의한것.

여기서는 WES 를 통한 exotic deletion, duplication 의 detection은 진단에 포함되지 않았음. 단 SNP array 를 QC로 했기에 3명의 환자에서 large deletion, CNV가 발견할 수 있었다. 또한 mitochondria 역시 sequencing을 했기에 2명의 환자에게서 causal variant를 찾을 수 있었다.

분자 진단은 관측되는 phenotype, 예상되는 inheritance와 일관성이 있는 Mendelian disease gene의 pathogenic 혹은 likely pathogenic 만을 포함한다.

각 환자들에게 하나 이상의 HPO를 할당. 그래서 이 HPO를 이용해서 phenotype class 별 진단 비율 확인.

아래 표는 환자의 나이별 분포 및 진단 비율

486명의 환자의 WES 결과 중 85명의 환자에게 분자 진단이 내려졌고 진단이 내려진 환자 중 2 환자는 mitochondria에의 deletion(mitochondria sequencing을 통해 확인), mutation에 의한 것이였고 3환자의 경우 CNV, large deletion에 의한 것(SNP array를 통해 확인). 나머지 환자 80명들의 진단은 WES 에 의한 것으로 111개의 distinct variant가 원인으로 밝혀짐.

111개의 variant중 SNV가 84개(75.7%), indel 이 26(23.4%)개, 나머지 한개는 double mutation variant. 84개의 SNV중 57개가 missens, 16개가 nonsense, 10개가 splice site, 1개가 initiation codon mutation.

아래는 inheritance pattern의 비율.  JAMA의 것(신생들의 분석 결과)과 비슷.

아래 표가 사용된 HPO term의 빈도수

 위 표는 환자들에게 할당된 HPO term들의 빈도를 의미한다.

환자당 평균 10개의 HPO term이 할당. HPO term을 바탕으로 환자에게 하나 이상의 HPO phenotype class 부여. 아래 그림에서 볼수 있드시 신경계, 근육 조직, 골격계의 비정상이 가장 많은 class 이다.

아래 그림 b 에서 볼수 있듯 진단은 phenotype에 dependent 하다. 머리/목, 성장, 근육 조직, 신경계 등의 문제가 있는 경우 진단이 더 잘 되고 가슴, 종양등과 관련된 phenotype 의 경우 진단이 잘 안되었다.

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Enterotypes of the human gut microbiome

metagenome pipeline 1차로다가 만들고 난 후 요즘 genome NCBI에 submission 할려고 그것에 정신없느라 거의 논문이나 관련된 것들을 못봤다. 오늘은 metagenome 논문 하나 보고 그 담에 고걸 가지고 ppt를 만드는데 Prezi를 써볼련다. 아.. 떨려.. 과연 오늘 안에 다 할련지, 저녁에 회식도 있는데.. 딱 오늘까지만 할려고 하는데 해봐야지.
일단 metagenome 손 놓고 있으니 점점 맘이 떠나 갔는데 박사님이 던져준 논문 하나와 그 의도가 나를 그냥 바짝 interested in 하게 만들었다. 요즘 아니지.. 쫌 됐지.. 사람 똥으로다가 metagenome논문이 종종 나오는데(내가 알기로 이거 무슨 society가 있다) 특히 obesity 에 관해서 논문이 꽤 있다. 이번 논문도 그런건데(아직 확실치 않다. 읽어보지 않아서).. 여튼 그 의도가 뭐냐? 이거 사업성이 있다. 단순히 metagenome분석 해준다 하면 pipeline 만들고 돌려서 결과 report 해준다고 생각했는데.. 이거 진단으로도 갈 수도 있겠다. 이럼 이야기가 달라진다. 아니.. 나에 대한 자극도가 달라진다. 재밌겠다란 생각 든다. 함 보자.


일단 논문은 여기. 

Enterotypes of the human gut microbiome on Prezi

submission of genome - 4

NCBI submit 하면서 Q&A 와 최종 정리


genbank에 있는 genome의 annotation은 정해진 규칙이 없다. 곧 각자 어느정도의 로직을 가지고 annotation을 한것이며 NCBI에서 체크하는 것은 각 sequence의 id가 겹치지 않게끔 체계를 갖게 하는것 뿐이다. 


protein_id 는 locus tag를 따르기를 권유한다. genome submit하고 나면 나중에 protein들에 대한 accession number가 NCBI로 부터 할당되어 통보된다.


<Sequin 프로그램에서 주의 사항>
1. topology 변경
2. codon table 변경
3. protein page랑 annotation page는 넘겨도 된다. 나중에 sequin feature table로 로드하면 됨.
4. gene이 reverse strand 일때 annotation input 파일에서 end position이 start position보다 앞에 나와야 한다.
5.다 만들었다 싶으면 search에서 validate를 실행.


Sequin 프로그램이 오작동 하면 이건 input 파일이 잘못 된거다(내가 겪은 예로 genome 이 circular 인데 orf가 -strand로 genome 끝에서 다시 처음으로 연결된 orf가 있었다. 이때 위의 3번 주의 사항으로다가 아무 생각없이 annotation input file을 만들었더니 계속 오류가 나더라. 결국 다시 genome 셋팅하고 annotation position 다 바꿈).

submission of genome - 3

아직 NCBI에 submit 하는걸 완벽히 다 안거는 아니지만(특히 sequin 프로그램 사용법이 아직 약하다) 이번에는 journal of bacteriology 의 genome announcement 에 대해 좀 자세히 알아 보고 거기에 나온 논문 두개 정도 읽어보면서 어떤 내용을 넣어야 할지 정해보려 한다.


일단 뭔가를 읽기 전에 checklist를 생각해보자면..
1. 반드시 NCBI 등이 데이터베이스에 등록이 된 genome만 publish가 가능한가 확인
2. 500 words 안으로 써야 하는데 어떤걸 써야 하는가
3. annotation의 reference를 어떻게 처리 했나?




<genome announcement 논문 훓어보기>
뭐 어떤 균주냐 이런건 안 중요하고 
review 첫번째 논문
1.균주에 대한 intro: genus부터 소개, 왜 중요한지, source가 어딘지, 어떤 특성을 갖는지 등등
2.de novo assembly 전체적인 소개 및 annotation 방식 소개: 무슨 기계로 얼마만큼의 데이터를 만들어 냈는지 그리고 assembler로 뭘 썻는지,  CRITICA와 glimmer2를 이용해서 cds를 prediction했고, 그담이 이해가 안가는데 GO로 분류했고 상용 프로그램인 뭐를 썻다네.
3.genome에 대한 overview : 게놈 사이즈가 어떤지, ORF 갯수, 그리고 같은 genus 의 다른 species와의 길이 및 orf 갯수 비교. GC content.
4.orf annotation에 대한 overview : nr,cog blast 결과 보고. 다른 species에 없는 기능을 하는 유전자 소개


review 두번째 논문 
1.균주에 대한 intro : 이 균주는 beneficial 한 균주다 뭐 이런 내용.
2.또 균주 소개
3.시퀀싱 방법과 annotation 에 대한 내용: 이거 특이하게도 AB3700 DNA analyzer를 이용했다. 물론 solexa로 confirm을 하긴 했지만. 여튼 Yacop으로 orf  prediction했고 Uniprot, COG, KEGG, TIGRFAMs을 이용해 annotation했단다.
4.genome 에 대한 설명 : genome size, GC content, structural RNA 갯수, 몇개의 유전자가 putative function이 있는지, 


음 보아하니 유전자에 대한 comment 가 있어야 할 듯 하다. 다른 species와의 비교로 어떤 유전자가 더 있었다 이정도.. 


<genome announcement 논문 들어가야 할 list>
실험 방식(FLX+ sanger 3730), FLX 데이터 양(read, depth, paired-end), de novo assembler(GS De Novo Assembler version), 첫 de novo assembly 했을시 scaffold 갯수 및 양, sanger 3730으로 gap closing 시 read 양과 bp 길이, 어떤 프로그램 (phred/phrap/consed), annotation tool(glimmer3, rnammer, trnascan,) 및 방식(nr blastp, cog rpsblast, signalp, pfam) 




reference list도 10~15 개 정도로 하고, 쓸데 없는 말은 전부 배제하기로 한다. 논문 본연의 목적에 맞게 쓰도록 한다. 딱 지금 한 것만 쓰자.

submission of genome - 2

여행 다녀왔는데.. 봄이라.. 아.. 몸살인지 감기인지.. 거의 좀비 상태다. 아.. 힘들어 죽을거 같어.. 휴가를 내고 싶지만 벌써 놀러 갔다 오느라 이틀을 쓴 상태라 최대한 아끼려는 생각에.. 버텨볼려 했다가 탈수에 병원 응급실까지가서 드러누워버리는 바람에.. 내 태어나서 이리 고생해보긴 첨인듯. 아직도 머리가 어지럽지만.. 집에서 드러누워 티비보면 뭐할쏘냐.. 병이 낫는것도 아니고, 빅토르 위고는 억지로라도 글쓸려고 하인시켜서 가운가지고 가게 했다는데 같은 심정으로다가 회사에 일단 왔으니 뭐라도 좀 하고 가자..


일단 저번에 포스팅하면서 genome project 등록했고 locus tag prefix 까지 등록을 했으니 annotation 부분을 좀더 자세하게 읽어보고 Sequin 사용법을 알아봐야 할 것이다.


<annotation>
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/genomesubmit_annotation.html#disrupted_genes
일단 annotation 에 들어갈 feature들(gene, CDS, 등등)은 feature table(five-column tab-delimited table) 파일 안에 다 들어가 있어야 한다. 이 feature table 파일이란게 뭐냐 그럼. 이게 Sequin이나 tbl2asn 프로그램의 input 파일인 듯 싶다. 그럼 컬럼이 5개라고 했는데 뭐가 들어가냐? 1.start location of feature, 2.stop location of feature, 3.feature key, 4.qualifier key, 5.qualifier value.
딴건 별내용 없고.. 아 중요한거 하나 feature table에 맨 첫줄에 >하고 나서 seqid를 넣어야 하는데 이는 fasta 파일의 seqid와 동일해야 한다. 그런데 뭘 seqid로 정하냐? 아하.. 이거 임시다. 아무거나 정해도 된다. NCBI staff가 review 할때 accession number로 바꿔준단다.  protein id는 locus id랑 동일하게 하면 될것 같고, CDS 가 반드시 product qualifier (protein name)이 있어야 하는거 같은데.. naming 에 대해서는 주의해야 할건.. function, cellular location 같은 정보를 이름에 담지 말아햐 한다(이는 note feature에 넣을 것). protein의 unkown 일때 hypothetical protein이라는 용어를 쓸것. 여차함 gene symbol이랑 같은거 쓰는데 단 첫글자는 대문자로 할것. multigene family에 속하는 것들(이게 좀 이상한데 multigene family 에 대한 항목과 sequence similarity나 function share에 의한 homology 항목을 분리 시켰는데 같은 의미 아닌가?) 숫자로 구분하고 복수형 단어는 사용하지 말것. 기능이 알려지지 않은 protein인데 defined domain을 갖었을 때 -containing protein 이라고 명명할 수 있다.
notes feature에는 데이터베이스의 entry와의 sequence similarity 를 넣는것을 피하란다.
tRNA의 경우 어떤 amino acid에 해당하는것인지 명시하고 잘 모르겠으면 tRNA-Xxx 라고 하란다. 
글고 2005년 미팅으로 /experimental과 /inference 라는 항목이 정해졌다는데 이 설명은 여기.
해석해보자면.. 2005년에 INSD, DDBJ, EMBL, GenBank 모여서 회의했을 때 feature의 evidence 항목에 대해서 새로히 뭔가 정했다는데..기존의 evidence=expermental이라는 항목을 대체해서 /experimental=text 라는 항목과 /inference=TYPE:text 라는 항목을 넣자고 정했단다. text는 규격화된 text(곧 설명한다)를 TYPE에는 정해진 list에서 뽑아서 선택하는거. experimental 항목은 말그대로 실험한 내용쓰는거, 단 간단하게. inference는 non-experimental evidence를 명시하는것. TYPE은  11가지중 하난데.(이건 직접 링크 따라가서 보자) 


??궁극적으로 의문이 드는건.. 그렇다면 annotation의 제한은 없다는 건가? 누구는 이런식으로 ORF를 prediction하고 또 prediction한 ORF의 protein을 특정 방식으로, 그러니까 sequence similarity로 만 따져서 protein naming을 해도 되는 것인가? 아.. 이거 그냥 inference 항목으로 사용한 프로그램 명시하면 되는건가? 뭐.. 관리자한테 메일 보냈으니 답장오겠지..근데 전에 COG 관련 해서 질문했다가 씹힌거 같은데.. 제대로 올려나 모르겠네. 


<Sequin>
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/QuickGuide/sequin.htm
사실 이 프로그램 별거 아니다(아.. 다만 내가 하려는거에 한해서만 이야기 하자면). 위의 feature table을 genbank format으로 바꿔주는건데.. (내가 만든 파이프 라인 돌아가면 biopython을 이용해서 genbank 파일 만들어주긴 하지만 아무래도 혹시나 라는 생각에 그냥 이거 쓰기로 한다) 뭐 여튼.. 
fasta 파일을 일단 읽어들이는데 의문점 하나가.. nucleotide sequence가 하나 이상의 protein product를 endoing 하면 2개의 파일, 그러니까 하나는 nucleotides, 다른 하나는 protein 을 위한 파일이 필요하다는데.. 이건 뭔소린지.. 더 읽어봐야 알듯. 글고 fasta 파일의 title 그러니까 첫줄( > 있는 라인) 에 각종 modifier를 이용해서 정보를 넣을 수 있는데 어떤 modifier를 써야 할지 모르겠다면 그냥 note 라는modifier를 써라(staff이 바꿔준단다). 

submission of genome

음.. 점점 1년 반동안 회사에서 했던 일들을 마무리 해야 겠다는 생각이 든다. 너무 한곳에 오래 있었던 거 같기도 하고 이제는 제자리 걸음을 하는게 아닌가 하는 생각이 든다. 해서 얼마전에 genome assembly를 끝낸 2 개의 균주에 대해 논문을 써볼려고 한다. 

계획하고 있는 논문은 journal of bacteriology의 genome announcements(http://jb.asm.org/misc/about.dtl). 음.. 이런 걸 논문이냐라고 할수 있을 정도의 것. 이 feature의 목적은 다만 genbank에 genome을 올리고 인증하는 정도하라고 할  수 있겠다(이 글이 이 논문의 목적을 가장 잘 설명하는 듯).

일단은 지금 해야 할 일은 두가지. NCBI에 어떻게 bacterial genome을 submit 하는지와 타겟 저널의 report 형식을 보고 writing 하는 것.

<NCBI submission instruction>

우선 NCBI submission instructions 부터 보자. 

Register your Project

일단 genbank에 올리기에 앞서 genome project에 등록을 해야 한다. 이때 locus_tag의 prefix도 정해 줘야 하는데 그 proposal은 다음과 같다. 요약하자면 locus_tag prefix는 3개 이상의 문자와 숫자(symbol은 사용 금지), 첫글자는 반드시 문자, 모든 유전자(structural RNA 포함, repeat region은 제외)는 고유의 locus_tag를 갖으며, 한 유전자의 여러 feature는 같은 locus_tag를 갖는다.
nucleotide sequence는 FASTA format을 따른다.

Annotation
complete genome 일때는 annotation은 필수. gene name(biological name) 은 standard bacterial nomenclature rule (three lower case letters)를 따르고 다른 loci는 대문자 suffix를 붙여 구분한다. 같은 genome project에 있는 genome이라면 동일한 locus_tag prefix를 사용해야 하고 유전자마다는 unique한 locus_tag(systematic identifier)를 사용해야 한다. 
CDS는 protein coding region으로 반드시 product qualifier(protein name)이 필요하며 여차하면 그냥 gene name이랑 같은 걸 써라(단, 첫글자는 대문자). 그리고 protein이 안알려진거면 hypothetical protein이라고 써라. 그래서 나중에 release 되고 검색하면 locus_tag로 대신 나타내게 하기 위해.
CDS의 한 qualifier 중 중요한게 protein id 인데 음.. (이것 좀더 자세히 읽어봐야 겠다)
structural RNA는 tRNA, rRNA만을 의미. 이것 역시 locus_tag 필요(그 위의 proposal에서 보면 RNA던 CDS 던 같은 locus_tag numbering 방식을 사용할것을 권장하나 굳이 locus_tag에 그런 정보를 넣고 싶다면 _t112 식으로 underscore 뒤에 쓸라고 한다).
자세한 내용은 다음을 참조한다.
Create your submission
submission file을 만드는데 Sequin과 tbl2asn 이렇게 두 개의 프로그램이 있다. 정확하게 아직 이 프로그램의 정체를 모르겠으나 여기서 말하기를 두 프로그램의 가장 큰 차이가 2개인데 Sequin은 GUI고 tbl2asn은 command line이라는거, 그렇기 때문에 아직 assembly가 미완이라 contig가 많거나 아니면 chromosome이 많을 경우 tbl2asn을 사용하는게 용이하단다, 아.. 그리고 assembly가 아직 완성되지 않았으면 WGS 에 submit해야 한다. 난 게놈 completion이 된거라 Sequin을 사용해본다. 아래의 것을 봐야 할것(뭐이리 볼게 많다냐.. 에이..).
Sequin Quick Guide : 

submitting 
FTP를 이용하거나 아니면 Genomes Submission Tool을 사용한다. 자주 submission을 한다면 NCBI에서 FTP account를 만들어 준다고 한다니 Email 보내란다. 
What happens next
일단 submission하면 NCBI 쪽에서 review하고 별문제 없으면 accession number를 보내준다. 그 뒤 다시 annotation에 대한 review가 들어간다.public release는 바로 할수도 있고 publication문제가 있다면 특정 기간 동안 release를 보류할 수 있다고 한다.


요약하자면
1.genome project에 등록하기 (locus_tag prefix 도 등록)
2.Sequin이나 tbl2asn 프로그램을 사용하여 submission file(.sqn) 생성
3.discrepancy Report 와 Genome submission check tool 로 annotation 파일에 에러가 있는지 체크
4.genomes submission tool을 이용해서 NCBI에 등록.

<Instructions to authors (journal of bacteriology) >

아 요거.. genome announcements가 July에 없어진단다. 시간이 없다.

나중에 de novo assembly 할때 필요할게 될거 같은 논문

이건 음.. 부분부분 tagging 해서 parallel 하게 시퀀싱 하는거
http://www.nature.com/nmeth/journal/v7/n2/full/nmeth.1416.html

hybrid assembly
http://genome.cshlp.org/content/19/2/294.long

metagenomics를 위한 논문 탐험

자 대략적으로 누구랩 레포트로 큰그림은 그려봤으니 실질적으로 논문들을 볼 차례다. 시작점은 a core gut microbiome in obese and lean twins로 한다. (참.. 이것 참.. 이 논문을 genomeweb에서 2년전쯤 논문 서머리로 슬쩍 본적이 있었는데 결국 보게 되다니. 참 이거. 참..) 그리고 CD-hit, species richness 통계 관련 논문, 마지막으로 mothur 논문 순서로 하기로 한다.
<A core gut microbiome in obese and lean>
http://www.nature.com/nature/journal/v457/n7228/full/nature07540.html


원래는 위에 것 할려고 했는데 윗분의 BGI언급으로 인해 아래 논문으로 수정
<A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing>
http://www.nature.com/nature/journal/v464/n7285/full/nature08821.html
이 논문의 위의 논문보다 나중에 나온것. 둘다 gut의 microbe 를 metagenome 연구를 했다는 공통점. 위 논문의 abstract만 보면 위 논문은 16s rRNA도 하고 전체 microbe의 genome (microbiome)을 시퀀싱 한거 같다. 이 논문은 Genome analyser (GA)를 가지고 124명의 유럽인들의 똥의 미생물의 microbiome, 그러니까 전체 genomic DNA를 시퀀싱. => 그래서 576.7 Gb 를 만들어냄(이전 논문의 200배, BGI에서 돈많이 썻다고 자랑함). => 그 뒤 assembly,=> 3.3 M 의 unique ORF 만들어냄. 그리고 마지막 말, 이 결과는 short read sequencing으로도 metagenomics를 할수 있음을 보인다는건데 이건 BGI가 illumina 계열의 기기만 있기 때문에 이것으로도 metagenome을 해도 된다. 뭐 이런 support를 위한 논문인냥 느껴지는 멘트이다. 그러면 short read sequencer로도 가능하냐? 이 문제에 대해선 다음의 논문[1] 을 추천하려 했지만.. 16s rRNA 에 대해서 물어본다면 답이 안되는 논문인듯 하다. 
metagenomic sequencing of gut microbiomes
124명의 건강하거나 과체중이거나 비만 혹은 염증성 장내질환(IBD)를 갖은 사람의 변의 microbe를 시퀀싱했다.두당 평균 4.5Gb 만들어냈고 이를 개인 각각 SOUPdenovo로 어샘블. 500bp 이상의 contig가 총 6.58M개 총 사이즈는 10.3Gb(N50 : 2.2kb), read의 42.7 %가 contig 만들어 지는데 이용됨. confirm으로 두 개체를 골라서 sanger 방법으로 시퀀싱한 리드를 contig에 매핑, 그 결과 98.7%가 맵핑됨. 이 값을 또 FLX와 비교(한 개체를 FLX로 시퀀싱한뒤 assembly해서 sanger read를 매핑해봄, 무서운 놈들). error-rate[2]와 뭐 이것저것 FLX에 떨어지지 않음을 증명. 어셈블 안된 리드들을 개체에 상관없이 모아서 다시 어셈블, 결과 0.4M개 총 370Mb(N50: 939bp) 의 contig 생성. 거꾸로 read들을 90% identity를 threshold(시퀀싱 error, strain variability를 고려해서)로 매핑, 결과 80%의 read가 매핑. 다른 논문의 데이터, 그리고 genbank와도 비교. 우월함을 입증.
a gene catalogue of the human gut microbiomes
ORF prediction에 MetaGene 사용. 100bp 이상의 ORF를 총 14,048,045개 찾음. 이건 총contig길이의 86.7%. 이는 평균적인 microbe의 비율과 비슷. (2/3의 ORF가 incomplete하다는데.. 이걸 어떻게 알지? incomplete하다의 의미가 정확히 뭔지 모르겠다). 그 ORF들의 redundancy를 없애고 총 3,299,822의 ORF로 추려냄, 이를 prevalent genes 이라고 함. 이 prevalent gene을 genome sequence가 있는 장내 세균과 비교. 상당수 매치됨. 음.. EstimateS 라는 프로그램을 써서 ICE를 계산해서 자기네들이 찾은 prevalent gene이 전체 추측되는 prevalent gene의 몇 %를 capture했나 라는 말이 나오는데 아.. 이는 잘 이해가 안된다[3]. 결론은 85% 이상을 capturing 한것으로 여겨진다는 것. 그리고 개체간에 얼마나 common gene이 있나를 체크했는데, 생각보다 prevalent gene이 생각보다 소수에 치우쳐 있다는 식으로 이야기함. 이것의 한 factor로 sampling depth를 들음. 그러나 역시나 개체간에 share하는 prevalent gene은 상당함. 재밌는것은 IBD 환자의 prevalent gene이 정상보다 갯수가 적음. 이는 IBD환자의 장내 미생물 diversity가 일반인보다 적다는 것과 일맥 상통.
common bacterial core


functions encoded by the prevalent gene set
ORF들을 NCBI의 NR(protein)과 KEGG, COG, eggNOG[4]에 있는 gene에다가 align함.[5]
bacterial functions important for life in the gut
functional complementarities fo the genome and metagenome








[1]http://aem.asm.org/cgi/reprint/74/5/1453.pdf 이논문이 2008년 초에 나온건데 abstract를 보면 100-200 bp의 read로 16s rRNA 시퀀싱 분석이 괜찮냐를 본 논문. 방법은 간단해 보인다. 거의 full length의 16s rRNA와 random하게 만들어낸 short read의 blast와 cog 분석 결과를 비교한다. blastx의 결과 당연하지만 full length에 비해 homolog hit이 현저하게 떨어진단다. 주의할 건 400bp 까지 read의 길이를 늘려도 내지는 depth를 늘려도 마찬가지라는거. 결국 Evalue가 낮은 hit 아니면 찾기 어렵다는것. 그리고 cog 분석도 마찬가지로 full... 근데 이거 16s rRNA에 국한된게 아닌듯 싶다. 그리고 nature 논문은 assembly후에 분석한 거라 이 의미가 없을 듯
[2]error-rate : 
[3]EstimatorS, ICE : http://viceroy.eeb.uconn.edu/EstimateSPages/EstSUsersGuide/EstimateSUsersGuide.htm
[4]eggNOG : http://eggnog.embl.de/
[5]rarefaction analysis :

RNA-seq 분석을 위한 논문 탐험

예전에 RNA-seq 한번 리뷰하고 거기서 ERNAGE라는 프로그램에 관한 논문을 정리 한적이 있었다. 이번에 정말로 RNA-seq 데이터를 다뤄야 하고 예전에는 거의 초점이 eukaryote에 맞춰졌기 때문에 bacteria의 transcriptome에 관련하여 좀더 논문들을 정리해 보고자 한다. 


start point 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3025319/
내가 분석해야 하는 대상이 미생물 균주, bacteria 이기 때문에 우선 위 논문을 시작으로 한다. 위 리뷰논문을 보면 관련 논문을 잘 정리해 놨다. 마지막 limitations에 관한 내용을 보면 RNA secondary structure, random hexamer priming, second strand synthesis, PCR amplication stage에 의해 문제가 유발되는데 이는 ion-catalyzed hydrolysis와 direct RNA sequencing으로 어느정도 해결 가능하다고 마무리.. 아 그리고 figure1 이 실험종류와 단계에 대한 정리를 잘해놨다(결론적으로 directional 이나 아니냐 둘로 나뉘는데.. 확실히 directional로 실험을 해야 맞는거 같은데.. 안타깝게도 우리 데이터는 아닌듯). 오른쪽 그림 참조


second paper
http://www.biomedcentral.com/1471-2180/8/72
음.. 우리가 non-directional 로다가 실험을 했기에 또 기기가 FLX인 관계로 위 first point 의 reference 중 상황이 가장 유사한 논문이 바로 위 url. 일단 genome size 가 대략 3Mb, megaplasmid 가 있는거 빼곤 우리 상황이랑 비슷하다. 
아.. 이 논문은 아닌거 같다. BMC microbiology에 나온건데.. 초창기 논문이라 그런지 아마도 FLX로 다가 transcriptome을 거의 처음 했다는 이유로.. rRNA depletion을 했는데도 read의 90 % 가 rRNA에 mapping되니. 그래서 아마도 논문의 방향을 novel gene finding으로 전환한듯. 여튼 패스..


third paper
http://www.sciencemag.org/content/326/5957/1268.short
좀 뭔가 의미 있는 내용을 보기 위해 그냥 선택한 논문. science니까. 첫번째 논문에서 인용도 많이 한거 같고. 음.. 읽어보니 확실히 사이언스다. 두번째 논문 봤을 때는 이거 일주일이면 하겠다고 생각했는데.. 
spotted array, tiling array, rna-seq (rna-seq 도 directional 한 방법을 이용) 모두 이용해서 operon의 boundary를 정한다 (expression이 급격히 떨어지는 region). 그리고 operon이 poly- | mono- cistronic 인지 확인한다 (rna-seq만 이용했을때 false positive가 얼마인지도 조사). operon을 정하고 나면 promoter region을 찾고 대략적인 TSS와 CDS와의 거리도 조사한다. 또한 trascriotion end site의 2차구조를 봐서 hairpin 구조가 transcription termination에 영향이 있는지 확인한다. polycistronic operon에 있는 gene들의 decay behavior도 관측한다. 여까지는 대략적인 transcriptome landscape라고 할까. 
그 뒤 여러 다양한 조건에서의 expression 변화를 가지고 context-dependent modulation of operon structure involving repression or activation of operon internal or end-located genes (아.. 그러니까.. 음.. 하나의 operon 안에 여러 유전자가 위치에 따라 module화가 되어 (suboperon 마냥) 상황에 따라 오듈 단위로 다르게 expression 한다 뭐 이런.. 맞나..) 을 봤다. 또 이와 같은 이유는 eukaryote 에서 처럼 다양한 factor의 작용에 의한 것이 아닐까 추측 그리고 factor가 될만한 후보자들을 가지고 expression clustering. 해서 아.. factor가 많음 갑다라고 추측.


중요한건 the proteome organiztion is not explainable by the genome organizaion. 그리고 the expression heterogeneity within operon 이 아마도 생각했던것보다 bacteria의 transcriptional regulation이 eukaryote과 많이 유사하기 때문이지 않나 싶다는 것.


fourth paper
http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/early/2009/10/24/bioinformatics.btp612.full.pdf
다음은 분석 툴에 대한 논문이다. 정확히 이야기 하면 R package. 


checklist
1. Segmentation algorithm : for identification of uncovered region in tiling array
2. Local convolution method : finding operon boundary
3. How do they decide polycistronic & monocystronic operon (maybe by DSSS)
4. In polycistronic how they divide genes in operon
5. Sigma 70 promoter region (TSS located within 60bp from CDS start site)

maq

short read alignment의 대표 프로그램, 1000 genome project에서 사용되었다. 사실 이 논문을 볼생각은 없었는데, 1000 genome 논문 정리하다가 
http://genome.gov/Pages/Research/DER/1000GenomesProjectTutorials/DataDescription-GaborMarth.pdf
genotype likelihood라는 용어가 나오는데 이것의 수식이 maq 논문에서 나왔기 때문에 어찌보면 가장 먼저 봐야 할논문이 아닌가 해서 정리한다. 완벽 이해는 아직 한계가 있지만 최대로 끌어 올려본다.



maq 설명


--alignment stage :
1. ungapped match with lowest mismatch score(the sum of  qualities at mismatching bases) in first 28bp(less than 2 mismatch)
2. failed in matching but whose mate pair is mapped are searching gapped alignment
3. maq assigns individual alignment a phred-scaled quality score
4. if read aligned multiple position, then maq peak one randomly and that mapping quality is 0.


--SNP calling stage :
1. produce a consensus genotype sequence inferred from a bayesian statistical model (그리고 이런 genotype consensus에다가 틀릴수 있는 확률을 phred quality로 할당한다)
2. compare consensus genotype sequence with reference to detect SNP
3. filter called SNP in step 2 by predefined rules(for compensation of simplificaton and assumptions used in the statistical model, treating neighbor positions independently)


Method

<--single end read mapping-->
1. build multipe hash tables to index the reads 
2. scan the reference against the hash tables to find the hits(potential read alignment postion)
In More Detail
1. indexing 
-모든 read를 메모리에 올린뒤, read를 indexing (1st template, 2nd template(complementary sequence of 1st template)의 sequence를 24bit integer로 hashing한뒤 이를 interger를 키로 해서 sorting & grouping), 이 정보를 hash table이 갖고 있음, 이런 hash table을 6개 만든다(sequence를 4조각내서 combination for allowance of 2 mismatch).
2. scan reference
-forward, reverse로 base-by-base로 28bp subsequence를 취해서 위의 1step에서와 마찬가지로 indexing한뒤 위 1번 step의 hash tables 에서 hit를 찾는다. 
-hit가 발견되면 28bp(seed) 뒤로 전체 시퀀스를 gap 없이 align했을때 mismatch의 quality를 합한다(q).
-coordinate of hit과 read ID를 또 다른 24-bit integer (h) 로 hash한다. 이는 나중에 mutiple alignment되었을때 같은 최저 q를 갖을때 random하게 position을 고를수 있게 한다.




<--Single end mapping qualities-->
mapping quality(Qs) = -10 log10 Pr{read is wrongly mapped}
Qs가 30 이란건 1/1000확률로 잘못 alignment될 확률을 뜻함
x를 reference, z를 read, u 를 position이라고 할때 
p(z|x,u)는 reference x의 posiotion u에서 read z가 나올 확률인데 이는 단순하게 생각하면 mismatch의 quality의 곱과 같다. 여튼 구하고자 하는 mapping quality,Qs(u|x,z) = -10 log10[1-ps(u|x,z)] 로 p(z|x,u) 를 베이지안으로 이용하면 구할수 있다 (x때문에 헷갈릴수 있는데 x는 reference 시퀀스이니 항상 주어져 있다고 생각하면 그냥 x를 제거해서 생각하면 된다). 그런데 이 베이지안을 구하기 위해서는 p(z|x) 를 구해야 하는데 이는 reference x의 모든 position에서의 p(z,x)의 합을 구해야 하는데 이는 실질적으로 불가능하다. 그래서 나온게 
Qs = min{q2 - q1 - 4.343 logn2, 4+(3-k')(qave -14)-4.343logp1(3-k',28)}
이는 supplementary에 유도되어 있음.
문제는 snp가 mapping시 base error와 같이 취급된다는 것인데, we should set the minimum base error probability as the rate of differences between the reference and the reads(이해한걸론 reference에 비해 실제 sample이 snp를 갖을 비율이 0.001이면, 곧 1000베이스당 1나의 베이스가 snp일 수 있다면 0,001 보다 큰 error확률을 갖는 mismatch base 만을 mapping quality에 사용해야 한다는 것). 그러나 이 역시 approximation이므로, 첫번째 mapping하고 reference를 변형한뒤 다시 mapping해서  mapping quality를 구하길 권장 




<--Paired-end read alignment-->


<--Detecting short indels-->


<--Consensus genotype calling-->
MAQ assumes the sample is diploid.
1.before consensus calling,  MAQ combines mapping quality & base quality (base quality used in SNP calling cannot exceed the mapping quality of the reads) and reasigns the quality as the smaller value between mapping quality & base quality.
2. genotype likelihood
계산시 최대 많이 나온 2 종류의 nucleotide에 대해서만 고려(나머지는 error로 간주)
이 역시 supplementary 참조
genotype likelihood = Pr(D|genotype) , the probability of data given each possible genotype.
3. prior of genotypes
heterozygote의 확률을  r이라고 가정하면 각각의 homozygote는 (1-r)/2 로 한다. known SNP에 대해선 r은 0.2로 novel SNP에 대해선 0.001을 설정
4. posterior probability
실질적으로 구해야 하는것 P(g|D), 데이터(reads) 가 주어졌을때 genotype의 확률로 g^ = argmax P(g|D) 를 genotype으로 취하고 그 observing quality를 Qg = 10log10 [1 - P(g^|D)] 

위랑은 크게 관련 있다고 봐야 할지는 모르겠지만. 그냥 참조
hash : http://internet512.chonbuk.ac.kr/datastructure/hash/hash2.htm

contrasting chromatin organization of CpG islands and exons in the human genome

최박사님이 올해 낸 논문.
음. 대단하다. 항상 그의 생물학적 지식에 놀란다. 이야기를 만들어 내는 스킬과 함께.
사실 네이쳐 급에 나오는 데이터 생산의 의미에 논문보다 솔직히 난 이런 논문이 더 어렵다고 생각한다. 이미 있는 데이터를 가지고 재조명한다는 것은 인용한 논문이 이미 누구나 쉽게 관찰할 수 있는 내용은 다 한번 들쳐 본것이기 때문에 더 주의 깊은 관찰력 내지는 좀 더 넓은 시야를 요구한다. 어떻게 보면 요즘같이 넘쳐나는 데이터 속에 필요한 생물학자가 아닌가 싶다. 
그래서 그런지 논문의 초점이 데이터 프레젠테이션에 있는 것이 아니라 논리 전개에 있다. CGI를 들여봄으로 시작해서 promoter 부위와 genebody 부위로의 확장 결국 CGI에의한 exon position effect와 functional effect 가지고 exon의 methylation에 대한 설명을 이어간다(전개를 이해하는데 상당히 오랜 시간이 걸렸다. 흐름을 못잡는 바람에). 더욱 RNA-splicing과 연관 시키기 위해서 exon들을 inclusiveness 에따라 분류하고 nucleosome과 CpG methylation의 패턴을 확인한다. 그리고 이런 패턴이 H3K36me3 에도 나타나는것을 확인한뒤 그럼 왜 이 세가지 요인(nucleosome occupancy, DNA methylation, H3K36me3) 가 얽혀 있을까란 생각을 한다. 그래서 expression 양에 따라 

아 아직도 잘 정리가 안되네..

내 언제쯤 이 정도 될까싶다. 
아마도 집중력 차이다. 한 문제에 대해 오래 생각할 수 있는.. 숙성일 수도 있고


이번 epigenomic 저널 클럽 발표 논문이다.






ppt

knock out, knock in, knock down - genetically manupulated mice and the nobel prize

http://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMp0707712

The New England Journal of Medicine 에 2007년도에 나온 논문
2007년도 노벨상 생리의학 부문에 대한 설명이다.

Eukaryotic Cytosine Methyltransferases

Yong-Gun Lee and I decided to write introduction and method of paper which we are planning. I don't want to fit introduction shortly after finishing research for publishing the paper. that's not the right order of work. Though this process, we try to make up for lack of story line.

This paper is quite long, but it's really good to understand a general concept of methyltransferase. Actually it's true that I deferred a study on DNMT families. Through this time, I will organize these things.

This paper was published in Annu. Rev. Biochem. 2005.

Introduction
     Cytosine Methylation in Host Defense and Genome Stability
     Cytosine Methylation and Gene Regulation
     Conservation Between Bacterial and Eukaryotic Cytosine Methyltransferase
The cytosine methyltransferase families of eukaryotes

1.Dnmt1 : 처음으로 purified & cloned 된 DNA methyltransferase. Cedar가 hemimethylaed DNA가 unmethyl보다 빨리 methylation된다는 것을 발견. Dnmt1은 hemimethylated DNA 의 methylation에 preference 하나 de novo methylation 기능도 있는것처럼 이야기를 한다(어떤 factor에 의해 inhibit 되어 있을지도 모르지만 여튼 methylation pattern이 유지 된다는 의미에서 de novo methylation 이 block을 당해야 해서). 처음 murine erythroleukemia cells의 Dnmt1의 cDNA를 찾았고, 이것은 1620개의 AA(1100 N-termi + GKGK.. + 500 C-termi)로 되어 있고 그중 C-terminal 쪽의 ~500AA가 bacterial restriction methyltransferase M.Ddel과 유사함을 알아냄.
N-termi를 보면 진화 과정에서 functional 한 domain이 늘어나는것을 볼 수있다.N-termi에 핵안으로 Dnmt1을 import 시키는 시퀀스(NLS domain)와 replication foci와 결합하는 시퀀스가 있다. 원래는 G0기에는 Dnmt1은 degradation되나 두번째 start codon에서 부터 생긴 짧은 Dnmt1은 그렇지 않으며 이 짧은 것만 가지고 있는 mouse는 생존가능.
mouse의 oocyte에는 Dnmt1의 짧은 폼만 있으며 이를 Dnmt1o 라고 한다(이와 같이 truncation되어있는것은 oocyte에서의 Dnmt1의 많은축적과 연관되어 보임).
Dnmt1의 functional domain 중 BAH(bromo-adjacent homology) domain은 protein-protein interaction module로 chromatin regulation에 속하는 protein에서도 발견된다. cysteine-rich region은 zinc ions과 결합하는데 기능은 안알려져 있지만 모든 mammalian의 methyltransferase와 MBD(methyl-binding domain) protein와 CpG binding protein에서 발견. GK(glycine, lysine) rich region은 N-termi와 C-termi를 연결해주는데 histone H4의 N-termi 와 유사하고 posttranslational modification의 역할을 하는게 아닐까 추측된다.
biological role of Dnmt1 :
loss of function allleles of Dnmt1의 결과 1. genome이 demethlation되어있고 2. homozygous embryos에서는 대부분의 imprinted gene의 biallelic expression이 나타나고 3.Xist 유전자의 demethylation결과 activation되서 모든 X chromosome 이 inactivation되고 4.exogenous marker gene의 mutation rate 올라가며 5.ES cells이 undifferentiated 상태에서는 정상적으로 크다가 differentiative 상태로 유도되면 apoptosis로 인해 죽게 되고 6.마지막으로 LTR transposons의 발현이 많아진다.
Heterozygosity for mutations in Dnmt1 결과 : 이것이 실제 측정가능한 demethylation에  영향을 미치는 지는 정확히 밝혀지지 않았지만 1.Dnmt1을 wild type의 10%정도 발현하게 했더니 생존 가능하나 성장의 제한이 생기며 lymphoma에 걸리 확률이 크게 높아지며 2. Dnmt1의 overexpression의 경우 imprinted loci에 unmethylated allele이 de novo methylation되는 현상이 나타났다(이는 Dnmt1이 methylation maintenance 역할을 한다는 것에 반하는 것).
DNMT1은 human colon cancer에서 200배 가까이 많이 발현된다는 것이 보도되어 있다(어떤 랩에서는 human colon cancer에서 다른 양상을 보이기도 한다). 일반적으로 tumor에서 m5C가 적어지는 것을 발견하는데 이는 Dnmt1의 발현이 많아지는 것과 모순되는 결과다.또한 아직까지 Dnmt1 유전자의 amplication이나 mutation으로 인한 cancer의 보고가 없기때문에 이것이 꼭 oncogene이라는 증거는 없다.
2. MET1 of A.thaliana : 처음 plant의 DNA methyltransferase는 A.thaliana에서 발견되었으며 이는 Dnmt1과 유사하였고 이름을 MET1이라 하였다. 시퀀스는 Dnmt1와 거의 유사(GK rich region이 살짝다르지만 C-termi 는 50% identity, N-termi 는 24%), BAH domain이 존재, cysteine-rich region은 없다. invitro 상에서는 MET1의 methylation 기능이 보고되지 않았지만 in vivo 상에서 homozygous mutation이 demethylation되고 phenotypic abnormalities가 나타난다. MET1의 mutant는 CpG 에 국한되어 demethylation이 나타나고 오히려 CpNpG의 methylation은 증가함을 보인다. 또한 MET1이 de novo methylation에 관여한다는 논문이 있다. homozygous mutation에 의한 demethylation은 식물에서는 후손의 heterozygous mutant나 wild-type segregants에 유전된다. 이는 각 세대마다 methylation pattern이 reset되는 mammalian과 차이를 나타낸다. 이는 genome을 알더라도 그 genome의 history를 알지 못하면 phenotype을 알 수 없다는 이야기가 될수 있다.
3. The Dnmt3 Family : 야기mammalian genome은 Dnmt3 family에 속하는 Dnmt3A와 Dnmt3B를 encoding한다. 또한 세번째 homologue인 Dnmt3L도 있는데 이는 methyltransferase activity는 없고 germ line에서의 regulatory factor로의 역할을 한다. 식물(A.thaliana)에서는 Dnmt3 family인 DRM(domains rearranged methyltransferase) family 는 methyltransferase의 motif가 circular permutation 되어 있다. 또한 Apis mellifera(꿀벌)에서도 Dnmt3가 발견됨.
-DNMT3A AND DNMT3B IN MAMMALS : Dnmt3A와 Dnmt4B의 시퀀스는 거의 유사하고 PWWP domain, cysteine-rich zyinc-binding region, MBDs를 포함하고 있다. hemimethylated 와 unmethylated 를 같은 rate로 methylation 하며 거의 CpG를 methylation시킨다. 그러나Dnmt3A는 CpA도 methylation 시킨다고 알려져 있다. adult cell에서 tissue마다 양이 다르게 발현되나 기본적으로 Dnmt1보다 발현양이 적다.


-DNMT3L :

-DNMT3 FAMILY MEMBERS IN INVERTEBRATES :
-THE DRM FAMILY : RNA-GUIDED METHYLTRASFERASES IN PLANTS :


4.DIM-2 and RID in N.crassa
5.Chromomethylases
6.Dnmt2
Methylated DNA binding proteins
regulatory inputs that control sequence-specific DNA methylation
     interatcion of Repeated seqeunces
     regulation of cytosine methylation by histone H3 Methylation
     swi2/snf2 helicase homologues and cytosine methylation
     RNA directed DNA methylation
conclusion

Reference-Free validation of Short Read Data

plos one에 얼마전에 나온 논문
NGS 데이터 파이프 라인을 구축하는데 가장 처음의 step으로 들어가게 될 프로그램이라 생각해서 리뷰를 해봤는데...
genome bias 에 대한 이야긴 줄 알았는데 그건 아니다. 하긴 read 만 가지고 전체 genome이 아닌 bias된 게놈만이 시퀀싱 된 줄 알수는 없다만..

이 논문은 리드 자체에 bias가 있는지를 체크 해볼 수 있는 프로그램이라고 보면 될거 같다.
read 별 각 position 별로 AGTC가 잘 분포 되어 있는지 또 k-mer로 정했을때 그 k-mer또한 분포가 position별로 동일한지를 체크 할수 있다 (체크 할수 있다기 보다는 그림으로 그릴수 있다 (우리같이 수주를 하는 사람들한테는 가능한 그림이 많이 들어가는게 좋아보이기 때문에).

java로 된 프로그램인데 사실 내용은 너무나 단순하다. 그런데 그 단순한 프로그램에다가 왜 두번째 analysis는 넣지 않은건지.. java 전혀 모르는 나에게 고생하면서 k-mer 일 때의 frequency가 나오게 만들게 하다니.. 아 그리고 quality 파일 만들어주는 변수가 int형으로 선언되는 바람에 read가 무자게 많으면 overflow나서 음수값이 출력된다는거..(스크립트 언어에 익숙한 나로는 이거 찾느라 피곤하게 됐다.)


알게된 내용:
1. mac에서 개발할 프로그램을 archive로 packing하면 __MACOSX가 딸려 생성된다는 것(첨에 프로그램 풀고 나서 이 폴더가 뭔가 했다.http://floatingsun.net/2007/02/07/whats-with-__macosx-in-zip-files/ : 이것에 대해 한소리 하는 블로거).
2. solexa 의 read가 첫 10 base의 퀄리티는 좋을지 몰라도 상당히 시퀀스가 안정적이지 못하다(뒷부분의 퀄리티가 안좋아 져서 항상 그것만 고려해서 trimming을 햇는데 앞부분의 시퀀스도 썩 훌륭한 경향을 보이지 않다니... 얼마나 짤라내야 하는거야...).


PPT

Dynamic changes in the human methylome during differentiation

hmm.. there is no impressive scientific observation, I think. Then the reason why I choose this paper for journal club is for hope that I could find something on relation between methylation and development. hmm. nothing.

PPT

Bowtie (short read alignment program)

I should have reviewed about mapper program (maq, bowtie..) earlier. Most of the first step in NGS data analysis is mapping read to reference genome. So knowing this process is prior to the others. But I just do this work now.

Here is the PPT.

ah.. I have to confess that some of slides in PPT come from mqoqol's ppt in SEQanswers.
Thanks mqoqol!

I found a blog today.
http://hackmap.blogspot.com/2010/07/aligners-since-starting-methylcoder.html

In the blog, the owner addressed shortcoming of Bowtie. And he introduced GSNAP. Actually in our firm, we made a tentative arrangement to use GSNAP for aligner.

I will also have to review the paper (GSNAP) ASAP.

The Language of Histone Crosstalk

organizing content of paper.. at first that's fun but more and more it's gonna be tiresome. below.. I just copy the sentences from paper.


이 논문을 보고 느낀게 아직 논문들이 글로벌한 패턴을 볼 수 밖에 없다는 것을 느꼈다. 같은 component 가지고 시간과 상황에 따라 다른 역할을 해버리니 각각의 position 별로 시간에 따라 정확한 기능을 알지 못한다면 잘못된 해석만이 나올 뿐이다. 그런데 이 시간과 포지션 별로의 데이터 양이 얼마나 될까? 인간 게놈이 30억인데 내 기억으로 하나의 히스톤에 감기는  dna의 길이가 백오십 베이스 정도였던거 같은데.. 물론 링커도 있지만 그렇다면 수많은 갰수의 hisone이 나오게 되고 hisone의 종류도 기본 3가지 뿐 아니라 사이드도 있고 게다가 modification도 phosphorylation과 mono-에서 tri-까지의 methylation과 histone 하나에서도 아미노산 하나하나의 modification이 가능하게 되면.. 음.. 모든 경우에 수는 우주의 원자 수보다도 많게 되는게 아닐까 (얼마전 읽은 책에서 보니까 원자수가 생각보다 적었던 걸로 기억, 물론 말도 안될 수 있지만).. 
그렇다고 해석하는데 포기할수 는 없지만.. 가히 포기 하고 싶어진다.





epigenetic code (histone modification) :
revealing a nuanced and intriguing language, not
a strict code, as the basis for transcriptional regulation through
the chromatin signaling pathway

1. acetylation of histone:

A well-characterized
posttranslational modification regulating chromatin
structure is the acetylation of histone N-terminal tails, which is
thought to facilitate transcriptional activation either by charge
neutralization of the tails’ interaction with DNA or by forming
a binding site for bromodomain-containing transcription factors, some of which can remodel nucleosomes

2. methylation of H3K4:

a modification generally associated with transcriptionally
active genes and a binding site for a variety of factors that include
histone-modifying and -remodeling activities

histone crosstalk: effect of prior nearby histone modification to subsequent histone modification
examples : first picture,
point mutation in H3K14 (acetylation site) results in the specific loss of H3K4 trimethylation.
phosphorylation of H3S10 interferes with binding of HP1 (heterochromatin protein 1) to methylated H3K9
reason : histone modification enzymes are constituted with multisubunit complex




example of histone crosstalk is the stimulation of
acetyltransferase activity of GCN5 toward the histone H3 tail by prior phosphorylation
(P) of serine 10. Acetylation, Ac.

understanding the activities of these histone modification crosstalk is not simple, because  the transcriptional readout depends on context and timing. Second figure represent this characteristics.
In A, show that depending on position and timing of binding of 14-3-3, a phosphoserine binding protein, to H3S10 it works differently. In B say that artificially increasing acetylation doesn't lead to productive trascription.
there is an example (fruit fly's dosage compensation study) which have different order of implementation of proteins.

Genome-Wide Evolutionary Analysis of Eukaryotic DNA Methylation

I had an idea about evolution of methylation in these days from the fact that methylation pattern is conserved in othologous region between species. I decided to dig about this concept, so I did googling first. I had scarcely searched the google when the title of this post was appeared. 



This paper which is published in SCIENCE.  


Here is the PPT.



this link is also good to read.
http://blog.lib.umn.edu/denis036/thisweekinevolution/2010/05/evolution_of_dna_methylation_i.html

SAM (sequence alignment/map format)

With advent of NGS, there are some projects such as 1000 genome project which can be possible by the technology. There are several  sequencing machines and tools for alignment, this cause confusion and trivial handling works of result data for downstream analysis. In my firm, we also felt this problem when members use different tool for mapping the reads. While we tried to find or decide a formal format, I found SAM, so I planed to introduce this to members in my firm.
what a pity! We found this after one year passed from when it was made. In these days I am disappointed a lot to people in firm and my stuffiness. I am really sick of the fact that what I can do is just following someone's work. I really hope to be a leader in front of development of science.


Anyway,


Because I am not familiar with binary format and compression file, I just skipped that part of the format specification.
Actually the ppt here is just brief introduction.
Here is the PPT.

list of presentation,
1.The sequence alignment/map format and SAMtools
2.Sequence Alignment/map format document 

<sam flag explanation> 
http://picard.sourceforge.net/explain-flags.html








<pysam 사용시 주의점>
pysam 에서는 mapping pos가 0 based 이다. 그래서 fetch를 할때 유전자의 정보가 bed 파일이 아닌이상 start position에 -1 값으로 fetch 를 해야 한다.